Alelos HLA-DRB1 en pacientes infectados con patógenos intracelulares en Rosario, Santa Fe / HLA-DRB1 alleles in patients infected with intracellular pathogens in Rosario, Santa Fe

En el desarrollo de la respuesta inmune a patógenos intracelulares participa el elevado polimorfismo de las moléculas HLA de clase II. El objetivo de este trabajo fue establecer la participación de los alelos HLA-DRB1 en personas con infección con Trypanosoma cruzi (T. cruzi) o con Mycobacterium leprae (M. leprae). Se estudiaron 252 individuos de la ciudad de Rosario, divididos en: 86 personas seropositivas para T cruzi (sin compromiso cardiológico de relevancia), 85 pacientes con diagnóstico de Lepra y 81 individuos controles, sin evidencia de patologías. El ADN genómico fue extraído de sangre periférica utilizando el método de salting out y empleado como templado para amplificar por PCR el segundo exón polimórfico de HLA-DRB1. Los alelos fueron tipificados mediante la técnica de PCR­-SSOP. La comparación de frecuencias mostró prevalencia de los alelos DRB1 *0409 y DRB1 *1503 en los individuos seropositivos para T. cruzi con respecto al grupo control. Por otra parte, el análisis estadístico indicó una disminución significativa del alelo DRB1 *1103 en pacientes con esta tripanosomiasis. Al examinar las frecuencias observamos en el grupo de pacientes con Lepra un aumento significativo de los alelos DRB1 *1401 y DRB1 *1406. Además observamos que las proporciones de los alelos DRB1 *0808 y DRB1 *1103 en los enfermos son significativamente inferiores con respecto al grupo control. Los alelos HLA DRB1 podrían actuar solos o en combinación con otros genes para conferir susceptibilidad o resistencia a estas infecciones en la población de Rosario, Argentina.

In the development of the immune response to intracellular pathogens implicated the high polymorphism of HLA class II molecules. The aim of this study was to establish the involvement of the HLA-DRB1 alleles in infected subjects with T. cruzi or leprosy patients in Rosario, Argentina. We studied 252 individuals who divided into: 86 positive people for T. cruzi without cardiac damage, 85 patients diagnosed with leprosy and controls 81 individuals without evidence of disease. Genomic DNA was extracted from peripheral blood using the standard salting out method and used as a template to amplify by the PCR the polymorphic second exon of the HLA­-DRB1. PCR products were hybridized separately with sequence-specifics oligonucleotides (SSOP). Statistical analysis indicated that of increased frequencies of DRB1 *0409, and DRB1 *1503 in individuals with Chagas' disease. DRB1 *1103 allele was prevalence in the group control and could be associated with resistance to the presence of trypanosomiasis. DRB1 *1401 and DRB1 *1406 alleles were significantly more prevalent in leprosy patients, whereas a decreased frequency of DRB1 *0808 and DRB1 *1103 alleles was found, by comparison with the group control. The HLA-DRB1 alleles could act alone or in combination with other genes to confer differential susceptibility and also protection to these diseases in Rosario, Argentina.

Estudio de las variantes alélicas del gen FUT2 en una población de Rosario, Santa Fe / Allele of FUT2 gen variables in a population of Rosario, Argentina

El estado secretor de un individuo está determinado por el gen Secretor (FUT2), responsable de la presencia de antígenos ABH en las secreciones del organismo. El polimorfismo del gen FUT2 muestra una gran variabilidad dependiente del tipo de población. Alrededor del 20% de los individuos caucásicos son no­secretores y presentan la mutación G428A. El objetivo de este trabajo fue estudiar las variables alélicas del gen FUT2 en una población de Rosario. Se trabajó con muestras de sangre periférica de dadores voluntarios (n=1728). Se determinó el estado secretor en plasma y saliva y el fenotipo Lewis. El ADN genómico fue extraído por la técnica de salting-out modificada y fue analizado por ASA-PCR con cebadores específicos para el alelo G428A y para el alelo wild type del gen FUT2. Los resultados obtenidos mostraron que el 77% de los individuos investigados fueron secretores y presentaron el fenotipo Lewis Le(a-b+). El polimorfismo G428A estuvo presente en homocigosis en un 7.5%, valor menor al reportado en la bibliografía para la población caucásica. El análisis molecular del gen FUT2 confirmaría la diversidad genética de la población investigada y podría ser utilizada como un marcador poblacional.

The secretor status is determinate by the secretor gene (FUT2) responsible of the ABH antigens expression in human secretions. About 20% of Caucasian individuals are non-secretors. The aim of this study was to study the allelic varieties of the FUT2 gene by a PCR reaction. We worked with peripheral blood samples of volunteers (n= 1728). We determinated the secretor status in plasma and saliva. The genomic DNA was extracted by an enzymatic digestion method and was analyzed by ASA-PCR with specific primers for the G428A allele and for the wild type allele of the FUT2 gene. The results obtained by serologic and molecular methods showed that the 77% of the investigate individuals were secretors. The G428A polymorphism had present in a 7.5%. The allelic varieties of the other non-secretor individuals different to the G428A might to correspond to other mutations. The molecular analysis of the FUT2 gene confirms the genetic diversity of the investigated population.

Pérdida de la expresión antigénica ABH en pacientes con lesiones orales precancerosas y cancerosas / Loss of ABH antigenic expression in patients with precancerous and cancerous oral lesions

Los antígenos ABH, productos de la interacción de 2 sistemas genéticos, Hh y ABO, están sujetos a leyes de herencia y pueden estar localizados no sólo en los eritrocitos, sino también en la mayoría de las células humanas. El objetivo del este trabajo fue investigar la expresión de antígenos ABH en pacientes con lesiones orales premalignas y malignas orales. Se trabajó con muestras incluidas en tacos de parafina de pacientes con lesiones orales (n= 57). Los pacientes fueron clasificados en 2 grupos: a) lesiones premalignas y malignas diagnosticadas clínica y anatopatológicamente y b) lesiones benignas (n=93). Se investigaron los antígenos ABH por la técnica de inmunoadherencia específica modificada. Se utilizó la adherencia al tejido vascular como control positivo y al tejido adiposo como control negativo. Los resultados fueron semicuantificados desde adherencia fuertemente positiva a negativa. Se observó una significativa relación entre la expresión antigénica ABH y el grado de malignidad de las lesiones analizadas (P Yates= 0,005). La pérdida de reactividad ABH en los sitios de mayor invasividad tumoral se correlaciona con el grado del desarrollo del tumor, el grado histológico y su malignidad.

The ABH antigens, which are produced by the interaction of 2 genetic systems, Hh and ABO, are subjected to laws of heredity and may be located not only in the erythrocytes, but also in most of the human cells. The objective of this paper was to investigate the expression of ABH antigens in patients with premalignant and malignant oral lesions. Work was done with samples included in paraffin plugs in patients with oral lesions (n= 57). The patients were classified into 2 groups: a) clinical and anatomopathologically diagnosed premalignant and malignant lesions, and b) benign lesions (n=93). The ABH antigens were investigated by the modified specific immunoadherence technique. Adherence to the vascular tissue was used as a positive control, whereas adherence to the fat tissue was considered as a negative control. The results were semiquantified from strongly positive to negative adherence. A significant relation between the ABH antigen expression and the degree of malignancy of the analyzed lesions (P Yates= 0.005) was observed. The loss of ABH reactivity in the sites of greater tumoral invasiveness is correlated with the tumor development degree, the histological degree and its malignancy.

Expresión antigénica ABH y carácter secretor en pacientes con lesiones orales precancerosas y cancerosas / Secretor status and ABH antigens expression in patients with oral lesion

Los antígenos ABH, productos de la interacción de dos sistemas genéticos Hh y ABO, están sujetos a leyes de herencia y pueden estar localizados no sólo en los eritrocitos sino también en la mayoría de las células humanas. El objetivo del este trabajo fue investigar la relación entre el carácter secretor de pacientes con lesiones orales pre-malignas y malignas y la expresión antigénica ABH en cortes histológicos de dichas lesiones. Se trabajó con muestras incluídas en tacos de parafina de pacientes con lesiones orales. Los pacientes fueron clasificados en 2 grupos a) lesiones pre-malignas y malignas y b) lesiones benignas. Se investigaron los antígenos ABH por la técnica de inmunoadherencia específica modificada. Se utilizó la adherencia al tejido vascular como control positivo y al tejido adiposo como control negativo. Los resultados fueron semicuantificados desde adherencia fuertemente positiva a negativa. El carácter secretor fue determinado por la técnica de inhibición de la hemaglutinación. En 21 de las 34 muestras se observó una débil expresión antigénica en áreas atípicas, y deleción total en las áreas histológicamente afectadas por neoplasia. En 8 muestras hubo pérdida total de los antígenos ABH tanto en áreas normales como patológicas, estos pacientes presentaron un mayor grado de malignidad y metástasis que aquellos que conservaron la antigenicidad. Los pacientes con lesiones orales pre-malignas y malignas presentaron un incremento del carácter no secretor (52,3 por ciento) respecto de la población control (19,5 por ciento) y de aquellos pacientes con lesiones orales benignas (15.4 por ciento). Se observó una importante asociación entre pacientes no secretores y deleción de los antigenos ABH en muestras de lesiones orales. Además, hemos encontrado, en el grupo no secretor, una mayor malignidad de las lesiones orales como así también una mayor presentación de displasia epitelial. El estudio del carácter secretor en los pacientes con lesiones orales...

Determinación de IgG en eritrocitos senescentes por un ensayo enzimático con consumo de antiglobulina / Determination of senescent red blood cells bound IgG using an enzyme test based an the consuption of antiglobulin

Durante el envejecimiento de los GR se acumula IgG autóloga sobre la membrana eritrocitaria. Esta IgG esta dirigida a un neo antígeno de senescencia, ubicado en la proteína banda 3. El objetivo de este trabajo fue determinar pequeñas cantidades de IgG en la membrana del GR utilizando un inmunoensayo con antiglobulina conjugada con una enzima. Las suspensiones de GRSe y GRJ fueron incubadas con anti-IgG humana conjugada con fosfatasa alcalina. Se transfirieron alícuotas a microplacas sensibilizadas con IgG humana. Se agregó el sustrato de la enzima y se midió la IgG libre. Las concentraciones de IgG unida a la membrana eritrocitaria en GRSe (13.31 x 10-4(g/(L(1.57 x 10-4) fueron significativamente mayores (p(0.0001) que los valores observados en GR (3.35 x 10-4(g/(L(1.39 x 10-4). Los resultados obtenidos indican que esta metodología constituye una herramienta útil para determinar pequeñas contidades de IgG unida a la membrana eritrocitaria.

Enfermedad hemolítica fetoneonatal: estudio prenatal del genotipo RHD / Feto-neonatal hemolytic disease: prenatal study of RHD genotype

El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia del gen RHD en células fetales obtenidas de líquido amniótico por PCR. Se estudiaron 65 muestras de líquido amniótico, 11 de madres RhD negativas sensibilizadas con anti-D. Se confirmó el origen fetal del ADN analizando un locus VNTR y 3 loci STR en las muestras de ADN de líquido amniótico y sangre materna. En las muestras no contaminadas (n = 62) se realizó la genotipificación RHD utilizando una estrategia de PCR multiplex que permite la obtención de tres productos de amplificación en los fenotipos RhD positivos y sólo un fragmento de ADN en los fenotipos RhD negativos. Se genotipificaron 54 fetos RhD positivos (8 de madres RhD negativas sensibilizadas) y 8 fetos RhD negativos (3 de madres RhD negativas sensibilizadas). La genotipificación del ADN fetal permite diagnosticar con una única amniocentesis fetos en riesgo real de enfermedad hemolítica fetoneonatal y evitar la utilización de métodos invasivos en casos de fetos RhD negativos.

Nuevas estrategias para el análisis genético y molecular del sistema Rh / New strategies for molecular and genetic analysis of Rh system

El locus RH está compuesto, en cada cromosoma de individuos RhD positivo, por dos genes estructurales, adyacentes y homólogos, denominados RHCE y RHD, que codifican las proteínas RhCcEe y RhD respectivamente, mientras que en individuos RhD negativo se encuentra únicamente el gen RHCE. La determinación de las bases moleculares asociadas con los antígenos y fenotipos de este sistema permite investigar el gran polimorfismo del locus RH. El objetivo de este trabajo es estudiar nuevas estrategias para el análisis genético y molecular del sistema Rh. Investigamos la organización genética general del locus RH en individuos pertenecientes a la población de Rosario con distintos fenotipos Rh. En muestras de ADN genómico de dadores voluntarios analizamos dos regiones diferentes del gen RHD mediante el diseño de una estrategia de PCR multiplex basado en el polimorfismo de longitud del intrón 4 y en la presencia de una secuencia específica en la región 3' no codificante del gen RHD. Los resultados obtenidos con esta estrategia molecular presentaron una estricta correlación con los hallados por métodos serológicos. Los estudios realizados en la población analizada en este trabajo indicaron que todos los individuos RhD positivo poseen los dos genes RH, mientras que las personas RhD negativo tendrían solamente el gen RHCE. Se estudiaron 15 muestras RhD positivo débil, observándose siempre el patrón de bandas característico de las muestras RhD positivo. Estos resultados permitieron descartar fenotipos RhD negativo en las muestras con aglutinación muy débil y la presencia, en estos individuos, de genes híbridos responsables del fenotipo D.

Erythrophagocytosis assay in patients with autoimmune hemolytic anemia

The aim of this paper is to evaluate the erythrophagocytosis assay (EA) in patients with autoimmune hemolytic anemia (AIHA). Direct antiglobulin test (DAT), indirect antiglobulin test (ITA) and EA were performed in blood samples from 46 patients with presumed AIHA. The EA was carried out incubating patients'erythocytes and peripheral blood monocyte. A total of 200 monocytes were analysed to determine the percentage of active phagocytic cells (porcentage APC). In 9 of these patients the applied treatment was evaluated by DAT,IAT and EA. In 14 transfusion requirements, the compatibility tets and EA were performed. For EA, patients'monocyte were incubated with erytrocytes from previously selected units sensitized with patients'sera. The porcentage of APC was 32.1 +/- 1.7 in 35 patients with positive DAT and 17.8 +/- 1.3 in 11 patients with negative DAT. This last value was significantly higher than that with negative controls (3.7 +/- 0.3) (p

Genotipificación del sistema RH en líquido amniótico / Rh system genotyping in amniotic fluid

El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia del gen RHD en células fetales obtenidas de líquido amniótico (LA) por PCR. Se estudiaron 65 muestras de LA, 11 de madres RhD-sensibilizadas con anti-D. Se confirmó el origen fetal del AND analizando un locus VNTR y 3 loci STR en las muestras de AND de LA y sangre materna. En las muestras no contaminadas (n=62) se realizó la genotipicación RHD utilizando una estrategia de PCR multiplex que permite la obtención de 3 productos de amplificación en los fenotipos RhD+ y sólo un fragmento de AND en los fenotipos RhD-. Se genotipificaron 54 fetos RhD+ ( de 8 madres RhD- sensibilizadas) y 8 feto RhD- ( 3 de madres RhD- sensibilizadas). La genotipificación del AND fetal permite diagnosticar con una única amniocentesis fetos en riesgo real de enfermedad hemolítica fetoneonatal (EHFN) y evitar la utilización de métodos invasivos en casos de fetos RhD-.

Aplicaciones clínicas de la prueba funcional de eritrofagocitosis / Functional test of erythrophagocytosis : clinical aplications

Debido a la multitud de factores humorales y celulares que intervienen en la destrucción eritrocitaria, es difícil correlacionar la alteración in vivo con las pruebas in vitro. Hemos desarrollado el ensayo de eritrofagocitosis para ser utilizado como parámetro evaluador de los fenómenos que ocurren in vivo. Esta pruba estudia la capacidad de adherencia y fagocitosis de los monocitos de sangre periférica para hematíes sensibilizados. Se ha demostrado su utilidad en el diagnóstico de AHAI por anticuerpos calientes, fundamentalmente en pacientes que presentan la prueba de la antiglobulina directa sistemáticamente negativa. También permitió realizar el seguimiento y respuesta al tratamiento de estos pacientes, que presentaron prueba de Coombs directa e indirecta positiva, independientemente del número de moléculas de IgG presente por GR. Los porcentajes de CFA obtenidos mediante la prueba de eritrofagocitosis fueron variando de acuerdo con el tratamiento aplicado, indicando una modificación en los niveles de IgG presente en los hematíes. Este ensayo funcional fue aplicado también en el estudio de aloanticuerpos. La EHFN resulta a menudo difícil de predecir por pruebas serológicas de rutina, debiendo recurrirse a métodos invasivos. Hemos aplicado la prueba de monocapa de monocitos, reflejando una mejor correlación con el estado clínico del bebé que las pruebas serológicas realizadas. En Medicina Transfusional es de importancia determinar el significado clínico de los anticuerpos que presentan reactividad contra antígenos de muy alta frecuencia. El ensayo de monocapa de monocitos fue realizado en pacientes con requerimiento transfusional que presentaron pruebas pretransfusionales positivas. Se transfundieron las unidades de sangre con menor porcentaje de CFA. Este ensayo celular presenta una mejor correlación de la hemólisis desarrollada in vivo, pudiendo ser aplicado cuando no se disponga de sangre compatible.

Prueba de compatibilidad inmunogenética / Immunogenetic compatibility test

En este trabajo presentamos nuestra experiencia en la utilización de la prueba de compatibilidad inmunogenética para establecer vínculos biológicos en tríos típicos. En la década del 70 nuestro Servicio utilizaba únicamente los sistemas eritrocitarios que nos permitían excluir solamente el 20 por ciento de los hombres falsamente alegados como padres. Posteriormente incorporamos al estudio de los antígenos del sistema HLA, que posibilitó la inclusión del padre alegado como biológico, con probabilidades de paternidad comprendidas entre el 90 al 98 por ciento, según la frecuencia poblacional del halotipo HLA obligado. El desarrollo de las técnicas de biología molecular ha permitido incorporar a las pericias realizadas en nuestro laboratorio el análisis del polimorfismo del ADN. Proponemos que la prueba de compatibilidad inmunogenética comprenda el estudio de marcadores fenotípicos (antígenos de los sistemas eritrocitarios y del sistema HLA) y genotípicos (polimorfismo del ADN). La utilización de esta metodología permite la inclusión de la paternidad con una confiabilidad de los resultados superior al 99,99 por ciento.